유전자 치료 제품의 바이러스 제거 검증 연구 프로토콜에 대한 주요 설계 고려 사항

ICH Q5A(R2)-국제조화재단

ICH Q5A(R2)는 2023년 11월 1일 공식적으로 채택되었으며, 바이러스 안전성 평가를 위한 핵심 국제 지침 문서를 나타냅니다. 1999년에 발표된 Q5A(R1)과 비교하여 R2 버전의 중요한 업데이트에는 다음이 포함됩니다. 연속 제조에서 바이러스 안전성 평가에 대한 장이 새로 추가되었습니다(7장). 바이러스 제거 전략의 기초로서 위험 평가의 강화된 역할; 바이러스 탐지 고려사항에 차세대 염기서열분석(NGS) 통합- 신규 제품 및 제조 공정 평가에 대한 명시적 요구사항. Q5A(R2)는 FDA, EMA 및 PMDA를 포함한 규제 당국에 의해 채택되어 전 세계적으로 바이러스 제거 검증을 위한 통합된 기술 프레임워크를 제공합니다.

NMPA-중국 규제 시스템

바이러스 안전을 위한 NMPA 규제 프레임워크는 여러 수준을 포괄합니다.

문서 수준	문서 이름	발행 연도
기초 문서	혈액 제제의 바이러스 제거/불활성화에 대한 기술 지침	2002
기초 문서	생물학적 조직-유래 제품 및 진핵 세포-발현 제품의 바이러스 안전성 평가 기술 검토에 대한 일반 원칙	2005
제품-별 가이드라인	재조합 아데노{0}}관련 바이러스(rAAV) 벡터-기반 생체 내 유전자 치료 제품에 대한 제약 연구 및 임상 시험 적용 평가를 위한 기술 지침	2023
제품-별 가이드라인	시판 허가 신청을 위한 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터-기반 생체 내 유전자 치료 제품의 제약 품질에 대한 공통 기술 요구사항	2025
혁신적인 가이드라인	치료용 재조합 단백질 제품의 임상 시험 적용을 위한 바이러스 제거 프로세스의 플랫폼 검증을 위한 기술 지침(시험)a	2024

a: 이 가이드라인은 중국 규제 당국이 바이러스 제거 과정의 플랫폼 검증을 위한 체계적인 기술 요구 사항을 최초로 제시한 것이며 ICH Q5A(R2)의 정신과 일치합니다.

FDA 및 EMA-미국 및 유럽 규제 요건

FDA는 2024년 1월에 ICH Q5A(R2)를 기반으로 업계 지침 문서를 공식 발표했습니다. 또한 미국 약전(USP) 장에서는<1050.1>바이러스 제거 절차의 설계, 평가 및 특성화에 대한 보충 기술 지침을 제공합니다. FDA는 2년마다 바이러스 제거 심포지엄을 개최합니다. 2023년 심포지엄에서는 새로운 방식, 연속 제조, 새로운 크로마토그래피 매체, 흡착 필터 등{2}}최첨단 주제를 다루었습니다. EMA의 핵심 지침 문서에는 CPMP/BWP/268/95(바이러스 검증 연구에 대한 지침: 바이러스의 불활성화 및 제거를 검증하는 연구의 설계, 기여 및 해석) 및 EMEA/CHMP/BWP/398498/2005(생명공학 연구 의약품의 바이러스 안전성 평가에 관한 지침)가 포함되며, 둘 다 ICH와 조화를 이룹니다. Q5A(R2).

바이러스 오염원 식별

ICH Q5A(R2)에서는 바이러스 제거 밸리데이션 설계가 포괄적인 위험 평가를 기반으로 해야 함을 강조합니다. 유전자치료제의 경우 바이러스 오염원 식별 시 다음 수준을 다루어야 합니다.

세포 은행 수준: 생산 세포 기질에 잠재적으로 숨어 있는 내인성 바이러스(예: 레트로바이러스 입자) 및 잠복 감염성 바이러스(예: HEK293, CHO, HeLa). HEK293 세포는 내인성 Ad5 E1 서열과 약 900bp의 EBV 단편을 포함하는 것으로 알려져 있으며 복제 가능 아데노바이러스를 발현할 수 있습니다. 따라서 위험 평가 시 이 위험에 특별한 주의를 기울여야 합니다.

헬퍼 바이러스 수준: AAV 벡터 생산은 일반적으로 복제 가능 아데노바이러스(RCA) 생성 위험이 있는 헬퍼 플라스미드를 사용한 삼중 형질감염과 같은 방법을 사용합니다. 마찬가지로, 렌티바이러스 벡터 생산에 사용되는 패키징 세포는 복제{2}}능력이 있는 렌티바이러스(RCL)를 생성할 수 있습니다.

원자재 수준: 세포 배양 배지, 사료, 효소 등 제조에 사용되는 원자재를 통해 외래성 바이러스가 유입될 수 있습니다. 이러한 위험은 동물- 유래 성분(예: 소 태아 혈청, 트립신 분해 용액)을 사용할 때 특히 중요합니다.

위험 차이: 유전자 치료와 전통적인 재조합 단백질

위험 차원	전통적인 재조합 단백질 제품	유전자 치료 제품
바이러스 소스	세포 은행의 내인성 바이러스; 외래성 바이러스	세포은행 바이러스; 도우미 바이러스; 복제{0}}가능 벡터(RCV/RCL); 숙주 게놈 통합
세포 기질	CHO, NS0, Sp2/0 및 기타{3}}특성이 잘 알려진 세포주	HEK293, HeLa, CHO 등; 일부 세포주는 종양성 기원을 가지고 있습니다.
제품특성	단백질- 기반 약물; 잘-정의된 구조	바이러스 벡터; 생물안전에 위험을 초래한다
검증 전략	다-단계 바이러스 제거; 프로세스 단계 검증 강조	RCV/RCL 감지가 필요합니다. 검증과 테스트 모두 필수
플랫폼 검증	S/D, 낮은 pH, 나노여과 등 확립된 공정에 적용 가능	벡터 유형의 다양성으로 인해 적용이 제한됨

표 1. 바이러스 안전성 위험 비교: 유전자 치료 제품과 기존 재조합 단백질 제품

일반 원칙

지표 바이러스 선택은 바이러스 제거 검증 프로토콜 설계의 핵심 요소입니다. ICH Q5A(R2)에서는 위험 평가를 기반으로 지표 바이러스를 선택하고 다음 요소를 고려할 것을 요구합니다.

생산 세포 기질(해당 바이러스)에 대한 바이러스의 관련성

바이러스의 물리화학적 특성(외피/비{0}}외피, DNA/RNA, 크기 범위)

물리적/화학적 처리에 대한 바이러스의 저항성

바이러스의 검출 가능성 및 생물학적 안전성

유전자치료제의 경우 지표 바이러스 선택 시 다음 사항을 추가로 고려해야 합니다. "관련 바이러스"로서의 벡터 바이러스 자체의 역할 헬퍼 바이러스 오염의 잠재적 위험; 복제 가능 바이러스(RCV/RCL)에 대한 감지 및 검증 요구사항-이 포함됩니다.

권장 지표 바이러스 패널

바이러스	유형	봉투	게놈	크기(nm)	선정 이유/적용
MVM	파보바이러스	없음	SSDNA	18–26	비-포위 모델; 가장 작은 크기와 가장 높은 저항; 나노여과 검증에 적합(일반적으로 rAAV 벡터 제품에는 적용되지 않음)
PPV	파보바이러스	없음	SSDNA	18–26	비-포위 모델; 혈액제제에 일반적으로 사용되는 지표 바이러스
레오-3	레오바이러스	없음	dsRNA	60–80	비-포위 모델; 엠; 높은 물리적 안정성
PRV	헤르페스바이러스과	예	dsDNA	150–200	봉투형 모델; 대판; 광범위한 호스트 범위
X-MuLV	레트로바이러스	예	ssRNA	80–110	외피형 레트로바이러스 모델; CHO-유래 세포 기질에 적합
BVDV	플라비바이러스과	예	ssRNA	40–60	봉투형 모델; 화학적 불활성화 방법(HCV 대용)을 평가하는 데 사용됩니다.
VSV	랍도바이러스과	예	ssRNA	70	봉투형 모델; 광범위한 pH 내성; 낮은-pH 불활성화 검증에 적합

표 2. 유전자치료제의 바이러스 제거 검증을 위해 권장되는 지표 바이러스 패널

AAV 벡터 제품에 대한 특별 고려 사항

재조합 AAV 벡터 제품의 경우 rAAV 벡터-기반 생체 내 유전자 치료 제품에 대한 제약 연구 및 임상 시험 신청 평가를 위한 NMPA 기술 지침에서는 복제 가능 AAV(rcAAV) 검출에 주의를 기울여야 합니다. rcAAV는 자율 복제가 가능한 AAV를 의미하며, 이는 일반적으로 헬퍼 플라스미드와 생성물 AAV 게놈 사이의 상동 재조합에서 발생합니다. rcAAV의 검출은 일반적으로 원료의약품과 정제 제품에 대해 별도로 수행되는 감염성 분석 또는 qPCR 방법을 사용하여 수행됩니다.

AAV 벡터 제품의 다운스트림 정제 공정에는 일반적으로 뉴클레아제 분해, 크로마토그래피(AEX), 나노여과 및 이온 교환 크로마토그래피(CEX/IEX)가 포함된다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 전통적인 바이러스 제거 검증에서 이러한 공정 단계는 AAV 벡터 자체의 상당한 손실을 초래할 수 있습니다. 따라서 축소-모델 설계 중에 벡터 바이러스와 지표 바이러스 간의 상호 작용을 신중하게 고려해야 합니다. AAV 벡터 손실이 상당한 특정 공정 단계(예: 나노여과)의 경우, 검증 데이터(예: 나노여과막 기공 크기 조정)를 기반으로 공정 조정이 타당한지 여부를 평가해야 합니다.

일반 원칙

축소{0}}모델(SDM)은 바이러스 제거 검증을 위한 핵심 도구입니다. 그 디자인은 제조 공정의 바이러스 제거 성능을 정확하게 나타내야 합니다. ICH Q5A(R2), 섹션 6.2.2에서는 축소-모델이 주요 매개변수에서 제조 공정과 일관성을 유지할 것을 명시적으로 요구합니다. 유전자치료제의 경우 SDM 설계 시 다음 고려 사항이 특히 중요합니다.

중요 공정 매개변수의 대표성

축소{0}}모델은 크로마토그래피 조건(완충액 구성, pH, 전도도)과 같은 매개변수에서 제조 공정과 일치해야 합니다. 로딩 비율(벡터/상등액 단백질 질량 비율); 접촉 시간 및 온도; 유속/체류 시간; 제품 순도 및 구성. AAV 제품의 경우 벡터 입자 크기 분포와 빈 캡시드 함량이 나노여과 성능에 미치는 영향도 구체적으로 다루어야 합니다.

모델 자격 요건

ICH Q5A(R2)는 다음을 포함하여 축소- 모델에 대한 적절한 검증을 요구합니다. 제품 품질 속성(예: 순도, 회수율, 밀도) 비교; 중요한 프로세스 매개변수 일관성의 검증; 축소-모델이 제조 공정의 공정 가변성을 포착하도록 보장합니다. 크로마토그래피 단계의 경우 피크 프로필, 용리 및 세척의 일관성이 검증되어야 합니다. 나노여과 단계의 경우 부피 용량과 제품 구성의 영향을 검증해야 합니다.

LRV 계산 공식

로그 감소 값(LRV)은 바이러스 제거 효능을 측정하기 위한 핵심 측정항목입니다. ICH Q5A(R2) 섹션 6.5에는 LRV 계산 방법과 통계 처리에 대한 자세한 설명이 나와 있습니다. 기본 LRV 계산 공식은 LRV=log₁₀(N₀/N)입니다. 여기서 N₀은 바이러스 스파이크 후 초기 바이러스 역가이고 N은 공정 처리 후 잔여 바이러스 역가입니다. 잔류 바이러스 역가가 분석의 검출 한계 아래로 떨어지면 포아송 분포와 같은 추정 방법을 사용해야 합니다(예: 대용량-용량 테스트).

신뢰구간 적용

ICH Q5A(R2)와 EMA CPMP/BWP/268/95 모두 LRV 계산 결과에 대한 신뢰 구간 평가를 요구합니다. 일반적으로 95% 신뢰구간이 적용됩니다.

유효성 기준

혈액제제에서 바이러스 제거/불활성화에 대한 NMPA 기술 지침에 따르면, 4로그 이상의 바이러스 감소는 해당 공정 단계가 바이러스 제거/불활성화에 효과적이라는 것을 나타냅니다. 그러나 이 기준은 절대적인 한계치가 아니며 불활성화 동역학 곡선, 지표 바이러스 선택에 대한 과학적 근거, 검증 프로토콜 설계의 전반적인 건전성과 함께 전체적인 방식으로 평가되어야 합니다. 유전자치료제의 경우, 전반적인 바이러스 안전성 프로필이 허용 가능한 수준이 되도록 모든 공정 단계에서 누적 제거 용량에 특별한 주의를 기울여야 합니다.

나노여과의 응용과 과제

바이러스-저류 여과(나노여과)는 유전자 치료 제품의 후속 정제에서 중요한 바이러스 제거 단계입니다. 일반적인 바이러스-보유 필터의 기공 크기는 약 20 nm입니다. 나노여과의 바이러스 제거 메커니즘은 주로 크기- 기반 배제이며, MVM 및 PPV와 같은 외피가 없는 작은 파보바이러스를 포함하여 막 기공 크기보다 큰 대부분의 바이러스를 효과적으로 제거할 수 있습니다.-

그러나 유전자 치료 제품의 나노여과는 독특한 과제에 직면해 있습니다. AAV 벡터의 크기(약 20~26nm)는 특정 지표 바이러스(예: MVM, 18~26nm)의 크기와 유사하여 벡터 회수율이 감소할 수 있습니다. 빈 캡시드는 여과 흐름과 바이러스 보유 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 샘플 점도는 벡터 농도에 따라 크게 증가할 수 있습니다. 따라서 나노여과 검증을 위한 SDM 설계는 여과 성능에 대한 벡터 입자 크기 분포 및 빈 캡시드 함량의 영향을 완전히 설명해야 하며, 적절하게 더 큰 기공 크기를 가진 나노여과막을 사용하는 것을 고려해야 합니다.

크로마토그래피 단계의 바이러스 제거 평가

이온 교환 크로마토그래피(IEX)는 AAV 제품 정제 공정의 핵심 단계로, 일반적으로 뉴클레아제 분해에 이어 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 사용하여 빈 캡시드와 결함이 있는 캡시드를 캡처하거나 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용하여 전체 캡시드를 정밀하게 정제합니다. 크로마토그래피 단계의 바이러스 제거 메커니즘에는 크기 배제, 정전기적 상호작용, 친화성 상호작용 및 기타 요인이 포함됩니다. FDA 2023 바이러스 제거 심포지엄의 토론에서는 크로마토그래피 단계의 바이러스 제거 효능이 로딩 용량, pH, 전도도 및 수지 순환을 포함한 여러 요인의 영향을 받는다는 점을 강조했습니다. 종합적인 평가를 위해서는 다중-요소 직교 설계 접근 방식을 채택해야 합니다.

지속적인 제조의 바이러스 안전 관리

ICH Q5A(R2)에 새로 추가된 7장에는 연속 제조 시 바이러스 안전성 평가에 대한 구체적인 요구사항이 명시되어 있습니다. 유전자 치료 제품의 경우 지속적인 제조가 중요한 개발 방향이 되었지만 새로운 바이러스 안전성 문제도 발생합니다. 연속 제조에서 바이러스 안전 제어 전략에는 다음이 포함됩니다.-중요한 봉쇄 수단인 인라인 바이러스 차단 필터; 체류 시간 및 공정 흐름의 적절한 설계; 정의된 보류 시간과 함께 비활성화 단계 통합 중요한 공정 매개변수의 실시간 모니터링을 위한 공정 분석 기술(PAT) 적용이 향상되었습니다.-